Questão 87251

A técnica de Sequenciamento de Nova Geração (NGS) revolucionou a genômica ao permitir o sequenciamento massivo e paralelo de milhões de fragmentos de DNA simultaneamente. Uma das plataformas mais utilizadas é a da Illumina, que se baseia no método de 'sequencing-by-synthesis'. Analise as etapas do processo de preparação de biblioteca e sequenciamento na plataforma Illumina.

I. A preparação da biblioteca envolve a fragmentação do DNA genômico, o reparo das extremidades, a adição de uma base de adenina na extremidade 3' ('A-tailing') e a ligação de adaptadores de dupla fita, que contêm as sequências para hibridização na 'flow cell', os sítios de ligação para os primers de sequenciamento e os índices para multiplexação.

II. A geração de 'clusters' ocorre na 'flow cell' através de um processo chamado 'bridge amplification'. Cada fragmento da biblioteca se hibridiza a oligonucleotídeos complementares na superfície da 'flow cell' e é amplificado por PCR, formando um 'cluster' clonal com milhares de cópias da mesma molécula. Todas as moléculas no cluster são então linearizadas e a extremidade 3' é bloqueada, para que o sequenciamento ocorra em apenas uma das fitas.

III. A etapa de sequenciamento propriamente dita envolve a adição cíclica de nucleotídeos modificados. Cada um dos quatro nucleotídeos (A, C, T, G) possui um fluoróforo de cor diferente e um grupo terminador reversível na posição 3'-OH. A cada ciclo, a polimerase incorpora o nucleotídeo complementar, a reação é pausada pelo terminador, a 'flow cell' é imageada para identificar o nucleotídeo incorporado em cada cluster, e então o fluoróforo e o terminador são clivados quimicamente para permitir o próximo ciclo de incorporação.

Quais afirmativas estão corretas?